人磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)ELISA试剂盒

检测方法 双抗夹心法/酶联免疫方法

规格 96T/48T

反应时间 3.5h

反应性 Rat

样本体积 100μL

检测范围：62.5 pg/mL – 2000 pg/mL。

特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

有效期：6个月

保存条件：2-8℃

可检测多种生物样品，包括：血清、血浆、体液如尿液、细胞培养上清液和细胞/组织裂解液等。

本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)的含量。

【实验原理】  

联迈生物生产的ELISA试剂盒采用“夹心法”:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的靶蛋白，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合， SABC复合物与生物素化检测抗体结合，形成免疫复合物，加入TMB显色液后，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加入终止液变黄色，检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，靶蛋白浓度与OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度。

【试剂盒组分】  

【样本处理及要求】  

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。 

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。 

5.其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。 

6.样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。 

7.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。 

8.如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。

样品稀释指导：

用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。

为避免样本中基质效应的影响，建议样本最少稀释一倍。

以上方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

【注意事项】  

1．为确保试验结果的有效性，建议先做预实验，以确定适当的稀释倍数。 

2．酶标板袋拆封后，尽快将不用的板孔放回，并放入干燥剂，保持酶标板干燥。

3．用户在初次使用试剂盒时，应将试剂盒平衡至室温，各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

4，TMB避光保存。

5，洗板过程非常重要，不充分的洗板易导致假阳性。

6．建议所有标准品、样本都做双份检测。

7．请保持试验过程的连续性，禁止酶标板干燥，因干燥会使酶标板上的生物成分迅速失活。

8．为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

9．禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。

【检测步骤概要】 

1) 准备所有的试剂和梯度稀释的标准品。板条加入300 μl 1×洗液静置浸泡30 秒。

2) 标准品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀释的标准品。空白孔加入 100 μl 标准品稀释液(血清/血浆样本)或培养基(细胞培养上清样本)。

3) 血清/血浆：样本孔加入 90 μl 1×检测缓冲液和 10 μl 样本。细胞培养上清：样本孔加入 100 μl 细胞培养上清。

4) 每孔加入 50 μl 1:100 稀释的检测抗体。步骤 2、3、4 在 15 分钟内完成。

5) 封膜，室温孵育 1.5 小时。

6) 洗涤 6 次。

7) 每孔加入 100 μl 1:100 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

8) 封膜，室温孵育 30 分钟。

9) 洗涤 6 次。

10) 每孔加入 100 μl 显色底物，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。

11) 每孔加入 100 μl 终止液。

12) 30 分钟内，在 450 nm 波长检测 OD 值，参考波长 570 nm 或 630 nm。

【结果判断】  

1. 以标准品的浓度为横坐标， OD值为纵坐标， 绘制标准曲线。 如有设置复孔，则应取其平均值计算。 以标准品的浓度为横坐标， OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。