4×LAMP MasterMix（含可视化染料）

产品及特点：

RT-LAMP MasterMix（可视化法）含有可视化 RT-LAMP 扩增所需的所有 成 分 ， 可 以 用 于 可 视化 RT-LAMP 等 温 扩 增 。 RT-LAMP 即 Reverse Transcription Loop-Mediated IsothermalAmplification（逆转录-环介导等 温扩增），它利用 4 条模板专一的特异引物、逆转录酶和具有链置换能力的 Bst DNA 聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30－60 分钟完成逆转录和 LAMP 扩增。 该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性 RT-PCR 技 术，还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测，广泛用于各 个领域。

本试剂盒具有下列特点： 

1. 即开即用，含有可视化染料，扩增后可以直接肉眼判读。

2. 高特异性，精心优化的配方，非特异扩增比自配的试剂更低。

3. 高扩增效率，一般比 RT-PCR 灵敏一个数量级。

4. 65℃左右逆转录和等温扩增，不需要贵重仪器。

5. 本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的可视化 RT-LAMP 扩增。

6. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。

7. 20uL 体系最多可以使用 10uL 样本。

8. 本产品只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分：

运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年

自备试剂：RNA 模板、RT-LAMP 引物

使用方法： 

1. 制备模板RNA：用于选用合适的方法制备模板RNA。如果有N个样品，最好设置N+2个样品制备，多出的两个一个是样品制备阳性对照，一个是样品制备阴性对照。

2. 配制5×RT-LAMP引物混合液。先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到标准所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到1mL的5×RT-LAMP引物混合液，此混合液足够250次20uL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×RT-LAMP引物混合液体积异于1mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置1年。

注：如果没有Loop引物，则用水替代。 

3.在冰上融化2×LAMP MasterMix，混匀，稍离心。第一次使用时，请将50uL Bst DNA聚合酶全部加入到2×LAMP MasterMix中轻柔混匀，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下组份，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：

注意：由于本产品含有可视化染料，故可能会对额外加入的荧光染料产生干扰。如果用户自己还要加入荧光染料，需要预先测试兼容性。

4.混匀，置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温，没有热盖，必须覆盖50uL的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，严重影响反应效率。 

5.扩增结束后肉眼观察结果判断阴性和阳性。典型的结果见下图：左边管为阴性，右边两个管为阳性。

6.结果分析：如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物呈现阳性而阴性对照为阴性，则实验有效。如果阳性对照-引物混合物呈现阴性，则操作有问题或者试剂盒有问题，请跟厂家联系。如果阴性对照（水作为模板）也呈现阳性，则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染，需要注意操作的规范性，如果不能解决，可以重新设计引物扩增新的靶片段。 

7.也可以电泳检测实验结果（强烈不推荐此法，因为电泳时产生的气溶胶非常容易污染环境，使得今后用同一引物扩增时产生假阳性）：取5-10uL扩增产物和自备的上样液混合，上样，进行2-3%的琼脂糖凝胶电泳，有LAMP扩增的样品将可见LAMP特征性电泳图谱

注意事项 

1. 引物设计对成功扩增十分关键，尽量以保守区设计引物。

2. 引物至少包括 F3/B3 和 FIP/BIP，加入环状引物 F loop/B loop 可以使反应速度大大提高。

3. 应优化引物序列、GC 含量和尽量避免二级结构。

4. LAMP 扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通 PCR 扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，很难去除，最好重新设计引物扩增新的靶片段。